Charakterisierung der membranständigen Phosphodiesterase NbdA aus Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa ist ein ubiquitäres Bakterium, welches sich an sehr verschiedene Umweltbedingungen anpassen kann. Man findet es in Oberflächengewässern, im Boden aber auch als opportunistisches Humanpathogen. Die Bildung von Biofilmen aus Pseudomonas aeruginosa ist dabei von besonderer Bedeutung. Ein zentraler Botenstoff zur Regulierung der Biofilmbildung ist zyklisches diguanosinmonophosphat (c-di-GMP). Die Phosphodiesterase NbdA aus Pseudomonas aeruginosa beeinflusst mit ihrer Aktivität dabei die Konzentration dieses Botenstoffes in der Zelle. Das Protein besteht aus drei konservierten Domänen, einer bisher nichtcharakterisierten membranständigen MHYT-Domäne, einer degenerierten Diguanylatzyklase-Domäne und einer Phosphodiesterase-Domäne. Die Phosphodiesterase-Domäne ist verantwortlich für die Spaltung von c-di-GMP zu dem linearen Dinukleotid pGpG. Die Aktivität konnte sowohl in vivo als auch in vitro nachgewiesen werden. Die Diguanylatzyklase-Domäne zeigte keine Aktivität. Funktion der membranständige MHYT Domäne ist bisher noch wenig verstanden. Wir vermuten eine Rolle in der Signalwahrnehmung und Regulation der enzymatischen Subdomänen. In unserer Arbeitsgruppe wollen wir die Funktion des Proteins, vor allem der Membrandomäne MHYT, verstehen, und welche Rolle diese in der Zelle spielt.
Um die physiologische Rolle dieses Proteins in der Zelle zu verstehen, untersuchen wir die Genregulation (Transkriptions- und Translationsanalyse) und die Lokalisation des Proteins in vivo (konfokale Mikroskopie). Zusätzlich versuchen wir zu verstehen, mit welchen Zellstrukturen und Proteinen NbdA interagiert (two hybrid und pull down assays).
Für die Charakterisierung des Membranproteins haben wir die Reinigung als rekombinantes Protein aus E. coli etabliert. Zusätzlich können auch Proteinvarianten, die durch Mutagenese und gezielte Trunkierungen erzeugt wurden, untersucht werden. Wir verwenden spektroskopische, biochemische und biophysikalische Methoden, um die Proteinvarianten und das Volllängenprotein genauer zu charakterisieren.